产品介绍
同科生物无缝克隆试剂盒价格,现货促销
价 格：￥电议
型 号：
产品完善度：
生产地：其他访问量：2次
发布日期：2017/6/28 14:51:52
更新日期：2017/10/31 13:10:41
详细内容
英文名称：Toneker Fast-Fusion Cloning Kit
产品规格：
| 产品编号 | 产品规格 | 产品价格 |
| TK01143 | 10次/盒 | ￥400 |
| TK01145 | 50次/盒 | ￥900 |
产品组成：
1、Fast-Fusion Enzyme
2、10× Fast-Fusion Buffer
产品简介：
Toneclone同源重组试剂盒基于DNA序列同源性进行片段重组，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～21 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在Fast-Fusion Enzyme的催化下，快仅需反应5 min，即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。
产品特点：
1、操作简便：无需考虑酶切点限制；
2、快速重组：15min实现载体和片段的快速重组；
3、效率更高：重组效率为传统酶切连接技术的5-10倍，无载体自连现象，阳性克隆可达90%以上。
产品应用：
1、PCR产物克隆进载体
2、基因转移
3、在插入片段前后插入adaptor、linker和标签
4、高通量克隆
实验方案
15 bp tract (F) BamHI Gene-specific Primer
5’-CAG GTC GAC TCT AGA GGATCC XXX XXX …-3’
Vecor pUC19
Clone site
5’-TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA G
AATTC ACT GGC CGT CGT TTT ACA ACG-3’
3’-ACG GAC GTC CAG CTG AGA TCT CCTAG
G TGA CCG GCA GCA AAA TGT TGC-5’
3’-… XXX XXX CTTAAG TGA CCG GCA GCA AAA-5’
Gene-specific Primer EcoRI 15 bp tract (R)
← Reverse Primer
D. 插入片段的PCR扩增
插入片段可选用任何DNA聚合酶进行扩增，Taq DNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用Taq DNA聚合酶，产物末端的A尾在重组过程中将会被去除，不会因此产生单碱基插入突变。推荐使用高保真酶进行扩增，以减少在插入片段中引入突变。请在PCR完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认获得单一条带的DNA片段。可切胶回收以除去模板、引物、引物二聚体。可通过与已知的DNA分子量marker比较，确定得到的DNA量。
E．重组反应体系的建立以及反应条件
在冰水浴中，配制如下反应体系，将缓冲、水、线性化载体、插入片段加入PCR管中，轻弹混匀，后加入酶。
| 组成成分 | 用量 |
| 10× Fast-Fusion Buffer | 1 μl |
| 线性化载体 | 20−100 ng |
| 插入片段 | 10−100 ng |
| ddH2O | 补加至10 μl |
| Fast-Fusion Enzyme | 1 μl * |
适线性化克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，可由下列公式粗略计算获得：
Ø 线性化载体 = [0.01 × 线性化载体长度 (bp)] ng
Ø 插入片段 = [0.01 × 插入片段长度 (bp)] ng
例如将长度500 bp的插入片段克隆到长度2.7 kb的pUC19中，克隆载体的适使用量为：0.01×2700=27 ng，插入片段的适使用量为：0.02×500=10 ng。
注意：1. 当插入片段大于克隆载体时，两者计算用量公式应互换。
2. 线性化载体用量应在20−100 ng之间，插入片段扩增产物用量应在10−100 ng之间。当使用上述公式计算DNA用量超出这个范围是，请直接选择/使用量即可。例如插入片段200 bp，适用量计算值为4 ng，实际反应体系中应加入10 ng。
反应体系配制完成后，轻弹混匀，并通过短暂离心使其沉到管底，立即放入已预热的PCR仪或平衡至所需温度的水浴中。按下表中方案选其一进行。推荐在PCR仪中进行反应，60°C，15 min。（若选择在37°C水浴反应，请在10 μl反应中加入2 μl Fast-Fusion Enzyme。）反应结束后应立即将反应管置于冰水浴中冷却10 min，然后直接转化。也可选择−20°C储存，待需要时，冰上解冻并转化。
| PCR热循环仪 | 水浴 | |
| 70°C, 5 min | 60°C, 15 min | 37°C, 15 min |
| 4°C, ∞ | 4°C, ∞ | 冰水浴 |
F．转化
推荐使用转化效率≥108 cfu/μg的感受态细胞，按照对应的说明书操作。若转化效率低于108 cfu/μg，可在凃布前将培养的菌液在6000 rpm离心5 min，沉菌用100 μl培养基重悬后，全部涂于对应抗性的平板上。过夜培养后，形成数百个单克隆，可根据需要选择PCR或酶切鉴定是否为阳性。
G．常见问题与解决方案
| 问题 | 可能的原因 | 解决方案 |
| 平板上无克隆或克隆数目很少 | 引物序列不正确 | l 确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。 |
| PCR产物不纯 | l 优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物。 l 换一种纯化方法，纯化您的PCR产物。 | |
| 反应体系中DNA浓度太低 | l 在重组反应中，加入推荐的DNA量。 | |
| 不纯的载体或插入片段抑制重组反应 | l 推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。 | |
| 转化过程中加入重组反应液过多 | l 重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。 | |
| 感受态细胞转化效率低 | l 更换新鲜、高效的感受态细胞。 | |
| 培养基中加入错误或过多抗生素 | l 在转化平板中加入正确、适量的抗生素。 | |
| 假阳性克隆数目多 | 克隆载体线性化不完全 | l 重新酶切您的载体，增加酶切时间，并胶回收纯化。 |
| PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染 | l 可在PCR反应之前先将模板质粒线性化。 l PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。 | |
| 转化用平板放置时间过长导致抗性失效 | l 确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。 | |
| 克隆含有不正确的插入片段 | PCR产物混有非特异性片段 | l 优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段。 |
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同科生物简介：成立于2007年，是一家集研发、生产、销售和技术服务于一体专注于生命医学和生物技术领域的高科技企业。主营业务有科研产品、诊断试剂、分子诊断和技术服务等，主要服务于科研机构、大专院校、医院和工业等客户。
生产科研：同科生物搭建多个研发与合作技术平台（博士后实践基地、院士工作站、同济大学人才培养与产学研合作基地及生物研究中心等），为技术创新提供了坚实的基础保障。拥有三类体外试剂生产中心、仪器生产中心、研发质检实验室等、厂房和实验面积达8000多平米，仪器设备设施先进齐全（包括定量PCR仪、生物安全柜、核酸蛋白测定仪、高压细胞破碎仪、FPLC等系列高端精密仪器设备）。
研发团队：同科拥有一支由中科院院士为顾问，国家千人为首席科学家，以博士硕士为主体的高效的国际化研发团队。研发人员专业涵盖生物化学、分子生物学、临床医学、免疫学、药物制剂、生物技术、遗传学、微生物学、生物工程领域，关联性较大，专业结构合理，且形成互补，在重大项目及关键技术上具备卓越的攻关能力。
仓储物流：在全国布局多个仓储基地，货品齐全，全国发货，及时给力！
技术支持：专业的技术团队，及时的技术指导，协助客户解决实验难题，愿意与您建立长期的合作关系。
