ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗ti，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各域的应用范围日益扩大，

组成结构

1、血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内du素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。

2、2、血浆：EDTA、柠檬suan盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。

5、保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血。如果血清中大量颗粒，检测先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作步骤：

1、使用，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2、根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5、每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7、每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8、取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9、在450nm波长处测定各孔的OD值。

操作注意事项：

1、试剂应按标签说明书储存，使用恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存

2、实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3、不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质使用。

4、使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5、使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6、底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

7、加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

一般来讲，96T能检测90个样本，48T能检测42个样本，这里面需要用标样来做标准曲线，所以各位需要做实验的老师们，请在购买ELISA试剂盒的时候注意，需要做多少个样本，在决定买多大规格的试剂盒，以免做实验时出现试剂盒不够用或者浪费！
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