国达黄曲霉毒素免疫亲和柱您的食品安全专家

1、方法简介：

本方法是用免疫亲和柱净化，高效液相色谱荧光法检测黄曲霉毒素 B1，B2，G1 , G2，M1和M2，此法可适用于果仁及其类似物，干水果，谷物，调味品，茶叶，咖啡，可可，及其他食品原料和饲料。

黄曲霉毒素易溶于极性的有机试剂，因此均匀基质中的黄曲霉利用甲醇/水通过摇晃或分散提取而得，对于高脂肪/油含量的样品基质需加入正己烷予以脱脂。然后过滤 PBS稀释。但对于饲料，调味品，茶叶，咖啡，可可等不用PBS而用吐温溶液稀释然后经玻璃纤维滤纸过滤，然后经 HPLC柱后光化学衍生荧光检测器检测。

2、提取步骤：

仪器，所需试剂，溶剂

黄曲霉毒素免疫亲和柱系列：免疫亲和柱系列  （1ml，25支/盒；3ml，15支/盒）；

高效液相装置：安捷伦  1200 系列 含泵，在线脱气机，自动进样器，荧光检测器，柱温箱；

光化学反应器：Photochemical   Reactor 另带反应圈和 UV灯；

色谱柱：XB-C18   5µm, 250 x 4.6 mm；

预柱：C18 4 x 2 mm；均质机；水平振荡器；搅碎机；滤纸；漏斗；锥形瓶：100 ml；玻璃纤维过滤器；SPE转接头及  50ml大容量上样器   SPE Adapter10 ml一次性注射器；

分析天平（精度 0.02 g）；1.8 mL自动进样样品瓶；移液枪；SPE装置带抽真空系统：SPE  Device

黄曲霉毒素B1, B2, G1, G2,M1,M2混标或需测单标；吐温  20；

PBS缓冲溶液：1.16 g  Na2HPO4/0.20 g  KH2PO4/ 8  g NaCl/0.2  g KCl  溶于

900ml水中，用HCL或NaOH调PH至7.4然后定容至1000ml；

磷酸氢二钠；磷酸二氢钾；氯化钾；氯化钠；去离子水；甲醇，分析纯；甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；正己烷，分析纯；

提取溶液：甲醇和水体积比80/20，对于泥浆样纯甲醇（分析纯）作为提取溶剂单独使用；HPLC

洗脱液A：水。

洗脱液B：甲醇/乙腈80/20 （v/v）。

吐温溶液：100ml吐温20溶于900ml水中

HPLC校正标准溶液：

由标准溶液配成目标物含量为1ug/kg的校正溶液前处理步骤：

花生果仁类似产品的提取（开心果，杏仁，杏仁壳，花生及其类似物）：称取50g浆状样（均质时加入100-300%水）加入5gNaCl（对于加标样品加入加标溶液），加入75ml纯甲醇然后均质3分钟或震荡提取30分钟。对于量少的样品，称25g干燥的均匀样，加入5g NaCl和100ml甲醇/水80/20 （v/v） 溶液，然后均质3分钟或震荡30分钟进行提取。将提取液用滤纸过滤或离心，上清液转移于100ml锥形瓶中。

对于特殊的花生酱或其他果仁酱，其外面有一层油脂，所以很难被提取。称25g样品，加入  5g NaCl，100ml提取溶液和50ml正己烷。用均质机提取3-5分钟，油脂部分会溶于正己烷相，过滤收集澄清液。

谷物牛奶类称取 ：

25g样于250ml锥形瓶中，加入5g NaCl，100ml提取溶液（对于加标样品加入加标溶液），然后在水平震荡器上150 rpm震荡30分钟。对于奶粉样品可称取2-5g加提取液溶解，如难溶解可适当加热，滤纸过滤，收集澄清液。

调味品，茶，咖啡，可可，饲料，医药品，辣椒提取物

称取20g干样，50g泥浆样，加入5g NaCl，100ml提取溶液，浆状样加80ml纯甲醇（对于加标样品加入加标溶液），然后在水平震荡器上150rpm震荡30分钟。滤纸过滤，收集澄清液。取5ml滤液加入20ml吐温溶液稀释，稀释液用玻璃纤维过滤器过滤。

空白值：

试剂空白值必须测定。

免疫亲和柱（IAC）净化

将免疫亲和柱置于固相萃取装置上，一个样品对应一根柱子；10ml PBS溶液活化柱子，流速保持在2–3 ml/min，确保上样前柱子保留少量（0.5ml）的 PBS溶液，活化液不收集；

1、花生，果仁类似物及谷物牛奶的提取液：3.1ml提取液用9.9mlPBS稀释。用12.6ml稀释液通过IAC，但流速不能超过5 mL/min。用约20ml去离子水淋洗柱子，其中10ml流速不得超过5 mL/min，抽真空1分钟；

2、调味品，茶，咖啡，可可，饲料，医药品，辣椒提取物：9ml稀释样品通过免疫亲和柱，流速不超过 5 mL/min。用约20ml去离子水淋洗柱子，其中10ml流速不得超过5 mL/min，抽真空1分钟；

用1.5ml甲醇洗脱；

（将柱子接于玻璃装置上，用0.75ml甲醇两次将目标物洗脱下来并收集于15ml 离心管中，起始在柱子上加压令其大概通过4滴液滴，然后利用重力让其自然流下，后通入空气令液体全部流出并收集。）

洗脱液用1.5ml水稀释并混匀,终体积为3ml；过滤后上机测试

注：具体免疫亲和柱使用方法可参考说明书

3. 液相色谱-荧光测定

仪器

液相色谱系统：

Agilent 1200二元高压泵

Agilent 1200真空脱气机

Agilent 1200恒温自动进样器

Agilent 1200柱温箱

光化学柱后衍生装置

色谱柱：XB-C18    250mm x 4.6 mm 5um

预柱：C18，4 x52µmmm

流动相：（乙腈：甲醇（50:50））：水=35:65

进样体积：20ul

流速：1 ml/min

柱温：35 °C

荧光检测器：激发：365nm；发射：450nm

激发：365nm；发射：450nm

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