1 引 言
高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC) 是一种较新型的液—液分配色谱,由美国国立健康研究院（National Institute of Health, U.S.A.）Ito博土研制开发，其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点[3]。目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[5]。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国FDA及世界卫生组织（WHO）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。本文对高速逆流色谱的原理特点及应用作一综述。
2 高速逆流色谱仪及溶剂体系简介
2.1 高速逆流色谱仪原理及特点
HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象。具体表现为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相（流动相），由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。
2.2 HSCCC的优点
HSCCC主要具有以下几个方面的优点。
2.2.1 应用范围广，适应性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离，所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。
2.2.2 操作简便，容易掌握。分离过程中对样品的前处理要求低，仅需一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。
2.2.3 回收率高。由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，理论上样品的回收率可达100％。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
2.2.4 重现性好。如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，那么多次进样，其分离过程稳定性都保持很好、峰的保留相对标准偏差也小于2%，重现性相当好。
2.2.5 分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高。研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。因此，在80年代后期被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。
最初的高速逆流色谱仪只有一个分离柱，用配重平衡离心体系。最近的仪器在设计上有较大突破，采用多个分离柱，不用配重，性能和实用能力大大提高。目前高速逆流色谱仪有分析型和半制备、制备型三大系列，较大的制备型HSCCC，柱容积可达1000mL，一次最多进样可达20g粗品。不但适用于非极性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离，对检测器的灵敏度要求不高。在制备分离方面，可用于天然产物中各组分的分离，也可进一步精制，甚至直接从粗提物一步纯化到纯品。
2.3 溶剂体系的选择
正确地选择溶剂体系是HSCCC分离成功的关键。通常所用的溶剂体系分为三类:亲水体系，由极性小的非水相与水相组成，两相极性相差很大；亲油体系，由高极性的非水相与水相组成，两相极性相差不大；还有一类处于两者之间，为中间体系。选择溶剂体系时遵循两个原则[6,9]：（1）溶剂体系的分层时间小于30S ；（2）目标样品的分配系数K接近于1，容量因子大于1.5。选择的方法有三种：参考前人体系、薄层色谱、液相。正己烷／乙酸乙酯／正丁醇／甲醇/水和氯仿／甲醇／水是比较经典的两个体系。对于未知样品混合物，推荐先采用正己烷／乙酸乙酯／甲醇/水(1∶1∶1∶1)或氯仿／甲醇/水(10∶3∶7)尝试，再根据目标组分的分配系数调整溶剂组成[9]。如可用乙醇代替甲醇增加体系的疏水性；加入盐(乙酸铵等)或酸(三氟乙酸或乙酸)增加体系亲水性。有文献报道：正丁醇／乙酸乙酯/水(3∶2∶5)适于分离极性大的物质，而正庚醇／乙酸乙酯／甲醇/水(6∶1∶6∶1)适于分离弱极性和非极性物质[10]。
近年来，溶剂体系的选择范围越来越广泛。有人用超临界二氧化碳(SFCO2)作流动相[11]，利用SFCO2高扩散性、低粘度、流体特性、环境友好等优势[12]。还有人用制冷剂R134a(1，1，1，2—tetrafluoroethane)作流动相。由于B134a这种流动相在常温常压下是气体，不必再富集或蒸干溶剂收集，从而避免了纯品的损失。有人提出当了解两相组成后，可以独立配制上下两相，避免溶剂的浪费[15]。
3 研究进展
3.1 天然产物
HSCCC使用的溶剂体系的组成是千变万化的，各溶剂的性质也各不相同，因而具有很强的适应性，为从复杂的天然产物中提取成分提供了有利条件。因此，国际上HSCCC被大量用于天然产物各类化学成分的分离纯化，如生物碱、黄酮类、萜类、木脂素、香豆素类等，以下为一些成功应用实例：
3.1.1 银杏 Gingkgo biloba
采用氯仿/甲醇/水（4:3:2）体系，可从银杏叶粗提物中一次分离得到白果内酯单体 [2]。（萜类）此外利用HSCCC与HPLC相结合，以水为固定相，乙酸乙酯为流动相，梯度增加异丁醇，至乙酸乙酯与异丁醇之比为（6:4），可一次分离出7个黄酮苷，纯度达98%以上。（黄酮）
参照蔡定国等论述的沙棘黄酮成分分离条件，从银杏叶浸膏水解物中分离得到异鼠李素、山奈酚和槲皮素，经HPLC分析，纯度达98%以上。（黄酮）
3.1.2 丹参
Salvia miltiorrhiza 使用三种溶剂系统，经HSCCC分极梯度洗脱，从丹参粗提物中一次分离纯化得到丹参酮IIA(tonshinone II A ) ，丹参酮I（tanshinoneI），隐丹参酮(cryptotanshinone)[3]。（蒽醌）
采用正己烷/乙醚/甲醇/水（8/5/10/4）体系，上相为固定相，分离丹参乙醚提取物，用丹参酮IIA标准品对照，经HPLC检测，得到的丹参酮IIA纯度达到99%。（蒽醌）
3.1.3 粉防己
Stephania tetrandra 粉防己主要含生物碱类。用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（3:7:5:5）为溶剂系统，从粉防己干燥根提取物中分离了粉防己碱（tetrandrine）、去甲粉防己碱（fangchinoline）和轮环藤酚碱（cyclanoline）。（生物碱）
3.1.4 黄连 Cotis chinensis 主要含小檗碱等生物碱。利用制备型HSCCC从黄连根生物碱粗提物中分离纯化得到巴马亭（palmatine）、小檗碱（epiberberine）及黄连碱（coptisine）[4]。（生物碱）
3.1.5 虎杖
Polygonum cuspidatwn 含蒽醌类化合物等成分。分别用氯仿/甲醇/水（4:3:2）、乙酸乙酯/乙醇/水（10∶1∶10）溶剂体系，经MS与1HNMR鉴定，从虎杖根的乙酸乙酯提取物及水提物中分离得白藜芦醇（resveratrol）、虎杖甙（polydatin）单体 [5]。
3.1.6 葛
Pueraria lobata 用乙酸乙酯/正丁醇/水（2:1:3）溶剂系统，可从葛根粗提物中一步分离得到包括葛根素（puerarin）在内的七个异黄酮类化合物[6]。（黄酮）
3.1.7 苹果 Malus pumila
苹果皮含有色素类成分。以乙酸乙酯/水（1:1）为溶剂系统（上层为流动相），一次进样得到了聚合程度不同的原矢车菊素(procyanidin)；用正丁醇/乙酸乙酯/乙腈/0.1%三氟乙酸（2:4:3:8）溶剂系统细分得Procyanidin A及procyanidin B[7]。
3.1.8 牛膝
Achyranthes bidentata 多糖类为牛膝活性成分之一。以12.5% PEG1000及65%磷酸钾缓冲液组成的水性二相系统，在正交轴式HSCCC上，实现了牛膝多糖的分离和纯化[8]。(多糖)
3.1.9 宽叶羌活
Notopterygium forbessi 以石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水(比例从5:5:4.8:5至5:5:5:4)为溶剂系统，从中分离得到notopterol、isoimperatorin，纯度在98％以上[9]。
3.1.10 红豆杉粗提物
采用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（2:5:2:5）及正己烷/氯仿/甲醇/水（5:25:34:20）为溶剂系统，分离纯化得到10-脱乙酰浆果紫杉素（10-deacelylbaccatin），纯度在98%以上[10]。此外，分别用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（6:3:2:5）和正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（1:1:1:1）为溶剂系统，从粗提物中分离纯化了三个结构相似的紫杉烷类二萜化合物质紫杉醇（taxel）、三尖杉宁碱（Cephalomannine）、浆果紫杉素（baccatin）。以石油醚（bp. 40～65ºC）/乙酸乙酯/甲醇/水（50:70:80:65）为两相体系，从紫杉醇的混合物中分离得到了纯的紫杉醇和三尖杉宁碱。
3.1.11 大黄
Rheum officinale 大黄含蒽醌类化合物，以氯仿/甲醇/水（6:3:2）为溶剂系统，从大黄根茎中分离出大黄素（aloe-emodin）、大黄酸（rhein）、大黄酚(chrysophanol)、和大黄素(cmodin)；用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（9:1:5:5）梯度洗脱，从掌叶大黄Rheun palmatum的根茎中也分离了大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄酚和大黄素，纯度在98%以上[11]。
3.1.12 盐生肉苁蓉
以乙酸乙酯/正丁醇/乙醇/水（4:0.6:0.6:5，v/v）为溶剂系统，从盐生肉苁蓉提取物中分离得到phenylethanoid glycosides(PhGs)、acteoside、2`-acetylacteoside，纯度在98%以上[12]。
3.1.13 山茱萸
以乙酸乙酯/正丁醇/水(5:1.8:6)及乙酸乙酯/乙醇/水(5:0.5:6)，从1g山茱萸果实的正丁醇提取物中分离得到60mg没食子酸(gallic acid)，纯度为97％[13]。
3.1.14 积雪草
Centella asiatica 主要含多种α-香树脂醇型的三萜成分。以氯仿/甲醇/异丁醇/水(7:6:3:1)为溶剂系统，从积雪草的抽提物中分离纯化得到结构非常相似的两种成分，积雪草苷（asiaticoside）和羟基积雪草甙(madecassoside)，它们仅在同一支链上有差别，前者是H，后者是OH。（萜类）
3.1.15 山楂
从山楂叶粗提物中分离金丝桃苷（hypericin）、槲皮素(quercetin)、芦丁(rutin)、牡荆素(vitexin)、异牡荆素(isovitexvin)；另外以氯仿/甲醇/水(33:40:27)体系，利用梯度洗脱技术，从山楂黄酮粗提物中分离出槲皮素、四羟基黄酮和槲皮黄酮。
3.1.16 唐古特山莨菪
Antsodus luridus 又称塞莨菪，主要含生物碱类。用氯仿/磷酸盐(0.07mol/L、pH6.4)(1:1)为溶剂系统，从唐古特山莨菪粗提物中分离出了山莨营菪碱（anisodamine）、樟柳碱（anisodine）等4个生物碱。
3.1.17 葡萄
Vitis vinifera 有人采用合适的溶剂系统，从葡萄皮及葡萄酒中分离出了各种色素，包括malvidin-3-glucoside(vitisin A、acetylvitisin A)、peonidin-3, 5-diglucosides、anthocyanins等[14]。
3.1.18 茶
以适当的溶剂系统从茶叶中分离纯化了儿茶酚(catechins)、黄酮醇葡萄糖苷类(flavonol glycosides)、strictinin、proanthocyanidins，并经1H NMR和HPLC-ESI-MS鉴定[15]，此外还从红茶中分离了茶黄素(theaflavine)、表茶黄酸（epitheaflavic acids）、thearubigins[16 ]。
3.1.19 黄柏
氯仿/甲醇/0.5mol/LHCl（2：1：1）体系，在不到2小时的时间内，经过TLC分析，一次分离得到6种单一的生物碱，一种含有两个成分的生物碱，并检出了小檗碱。
3.1.20 苦参
以氯仿/甲醇/NaH2PO4缓冲液（pH5.4）（27/20/13）为溶剂系统，上相为固定相，从中药苦参的总生物碱中共分得10个成分，其中9个与碘化铋钾试剂反应生成桔红色的化合物，并硅胶薄层板验证了分离效果，用MS证实了其中的苦参碱成分。
在考察NaH2PO4缓冲液的pH（5.4，5.1，5.5，5.9）对分离结果的影响时，发现pH5.4时分离效果，其余随pH的增大或减少，会使峰形消失。
另有人从苦参总碱中分离了苦参碱和氧化苦参碱。
3.1.21 青叶胆（云南獐牙菜）
以氯仿/甲醇/NaH2PO4缓冲液（pH4.8）（3/2.5/1）为溶剂系统，上相为固定相，从青叶胆总生物碱中分得5个成分，其中3个成分与碘化铋钾试剂反映显桔红色，用TLC验证了分离效果，并用红外光谱法证实其中一个为龙胆碱。
3.1.22 中药复方桂枝汤部分A
证实其主要成分是生物碱，采用二氯化碳/四氯化碳/甲醇/水（10/4/7/4）上相做固定相，经HPLC检测，得到一纯度98%以上的生物碱。
3.1.23 芦荟
以氯仿/甲醇/水（9/10.5/8）为溶剂体系，上相做固定相，从芦荟生药中一次性分离得到芦荟甙（99.99%）和芦荟大黄素（95.83%），分别达到定量和鉴别用化学对照品品要求。
3.1.24 洋地黄毒甙的纯化
采用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（6/3/2/5）体系，上相为固定相，经过同体系两次分离，对结构不太稳定的洋地黄毒甙，能的从含量72.5%提高到98.6%（HPLC、UV、IR）。在另外一次研究中，还成功分离纯化了异羟基洋地黄毒甙。
3.1.25 鬼臼毒素的纯化
用氯仿/甲醇/水（6.5/3.5/1）体系，下相做流动相，35min内得到鬼臼毒素和4/-去甲基鬼臼毒素的纯品。
3.1.26 香芹菜
用正己烷一乙腈一叔丁基甲基醚(10：10：1)从香芹菜中分离falcarind和falcarindiel；还从香芹菜中分离得到了2个C20化合物。
3.1.27小蔓长春花
用正己烷一乙醇一水(6：5：5)体系，从小蔓长春花植物的叶子中分离了长春胺和长春辛。
3.1.28委内瑞拉箭毒
以正丁醇一丙酮一水[8：1：10]体系，用于从委内瑞拉的箭毒中分离了马枯素和Panarine。
3.1.29 洋金花总碱
从洋金花总碱中分离了莨菪碱、东莨菪碱及待定成分。
3.1.30蛾眉干里光
从蛾眉干里光粗碱中分离了金缘干里光碱、阔叶干里光碱和新阔叶干里光碱。
3.1.31三尖杉总碱
从三尖杉总碱中分离了异三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱。
3.1.32 芫花总黄酮
用氯仿一甲醇一水(4：3：2)体系从芫花总黄酮中一次进祥100mg分离得到了3/羟基芫花素、洋芹素、木犀草素。
3.1.33大黄羟基蒽醌总甙元
从大黄羟基蒽醌总甙元中分离了大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等。
3.1.34Epilobiumparviflorum(柳叶菜属)
以两相系统氯仿一甲酵一水(7：13：8)，从Epilobiumparviflorum(柳叶菜属)的甲醇萃取物中分离得到了槲皮甙、杨梅甙、异杨梅甙和没食子酸。
3.1.35 黄酮混合物
以氯仿一甲醇一水(33：40：27)体系，在70min内从黄酮混合物中分离出橙皮素，四羟基黄酮和槲皮黄酮，并地利用了梯度洗脱技术；利用氯仿一甲醇一水(4：3：2)的两相系统对5个黄酮类化合物进行了分离并进行了定量分析。
3.1.36 Garcinia Kola(藤黄属)
利用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(1：4：2．5：2．5)从Garcinia Kola(藤黄属)种子中也分离出了多个双黄酮。
3.1.37青蒿
以异辛烷一乙酸乙酯(7：3)为固定相，甲醇一水(6：4)作为流动相，从青蒿中纯化出了Artemisinin；以异辛烷一甲醇一水(10：7：3)为固定相和流动相从青蒿中分离了epideox-yarteannuin。
3.1.38 Cochlospermum tinctorium(卷胚属)
利用四氯化碳一甲醇一水(5：4：1)的溶剂系统，将Cochlospermum tinctorium(卷胚属)的根的甲醇萃取物500mg溶解在10ml的1：1的两相溶剂系统中一次进样得到纯的cochloxan-thin和dihydrocochloxanthin。
3.1.39龙胆
以氯仿一甲醇一水(9：12：8)从龙胆的根的甲醇萃取物中分离得到了1个裂环烯醚萜甙。
3.1.40江花五味子
以正己烷一甲醇一水(6：5：5)的两相系统在80 min内从江花五味子果实的核的乙醇萃取物中分离了2个结构十分相似的木脂素的成分一schisanhend和它的乙酸化物。
3.1.41人参
以氯仿一甲醇一水的溶剂系统从西伯利亚人参的根中分离得到了纯的eleutheroside。
3.1.42香豆素混合物
用氯仿一甲醇一水(13：7：8)的两相体系，分离并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧(基)香豆素、7—羟基—6—甲氧基香豆素和7—羟基香豆素。
3.1.43毛地黄皂甙
以氯仿一甲醇一乙酸—水(5：3：1：3)的两相系统，从90mg的商品毛地黄皂甙中分离出几个强心甙的化台物。
A 生物碱
正丁醇一丙酮一水[8：1：10]曾用于从委内瑞拉的箭毒中分离马枯素和Panarine，样品进样达700mg；正丁醇一氯化钠[0.1mol/L]〔1：1〕的两相溶剂体系用于从Strychnos Usambarensis(马钱科)的树干和村皮中分离10—经基—Nb—甲基—柯楠醇；用四氯化碳一甲醇一水(20：20：2)从Aniso—cycla cymosa的根中分离得到了一个季铵盐生物碱和5个叔苄基异喹啉生物碱，用正己院一乙酸乙脂一甲醇一水(3：7：5：5)在70min内以1800r／min的转速从粉防已干根的提取物中分离了粉防己碱、去甲粉防己碱和轮环藤酚碱；从唐古持山莨菪粗提物中，用氯仿一磷酸盐[0.07mol/L、pH 6．4](1：1)的系统分离出了4个生物碱；从小蔓长春花植物的叶子中用正己烷一乙醇一水(6：5：5)体系分离长春胺和长春辛；将HSCCC与Ms联用分析长春胺和长春辛碱。分别用正己烷一乙酸乙脂一乙醇一水(6：3：2：5)和正己烷一乙酸乙脂一甲醇一水(1：1：1：1)从红豆衫的粗提物中分离纯化了紫杉醇、
cephalomannine、巴卡亭Ⅱ，以石油醚(bp，40一65℃)一乙酸乙脂一甲醇一水(50：70：80：65)为两相体系从紫杉醇的混合物中分离得到了纯的紫杉醇和cephalomannine。
有学者对粉防己的粗提物也进行了分离；从苦参总碱中分离了苦参碱和氧化苦参碱。从洋金花总碱中分离了莨菪碱、东莨菪碱及待定成分；从蛾眉干里光粗碱中分离了金缘干里光碱、阔叶干里光碱和新阔叶干里光碱；从三尖杉总碱中分离异三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱。
氯仿一甲醇一水(5：4：3)体系曾用于感染了枝顶孢属内部寄生菌的睡眠草，分离得到了麦角生物碱。Ito于1994年用新型的pH区带提取ccc技术从Crinum moores的抽取物中进祥3g得到了3个纯的生物碱，此技术是HSCCC的一个较大的突破，它使植物的分离提取每次很方便地就达到了克量级。
B 黄酮类似物
用氯仿一甲醇一水(4：3：2)体系曾从芫花总黄酮中一次进祥100mg分离得到了3/羟基芫花素、洋芹素、木犀草素；氯仿一甲醇一水(6：3：2)以1800r／min的转速在15min内从大黄根茎中分离出大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素；从山楂叶粗提物中分离金丝桃甙、槲皮素、芦丁、牡荆素、异牡荆素；以氯仿一甲醇一水(33：40：27)体系，700r／min转速，在70min内从黄酮混合物中分离出橙皮素，四羟基黄酮和槲皮黄酮，并地利用了梯度洗脱技术；Vanhaelen等将HSCCC与HPLC相结合从500mg的Ginkgo biloba(银杏属)的叶子萃取物中一次分离出了7个黄酮甙，其以水为固定相，开始以乙酸乙酯为流动相，然后在流动相中逐渐添加异丁醇,到分离结束时乙酸乙酯与异丁醇之比为(6：4)；Oka等以氯仿一甲醇一水(4：3：2)的体系在3500r／min下在8min内从See buckthourn的果实萃取物中分离得到了5个主成分,其分离速度可与HPLC相比较；还有学者也从大黄羟基蒽醌总甙元中分离了大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等；用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(9：1：5：5)在1800r／min转速下在70min内从掌叶大黄的根茎中分离出大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄酚和大黄素；将Epilobiumparviflorum(柳叶菜属)的甲醇萃取物进样2g分离得到了槲皮甙、杨梅甙、异杨梅甙和没食子酸，两相系统为氯仿一甲酵一水(7：13：8)。
Chenl992年利用氯仿一甲醇一水(4：3：2)的两相系统对5个黄酮类化合物进行了分离并进行了定量分析，Kapadial994年利用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(1：4：2．5：2．5)从Garcinia Kola(藤黄属)种子中也分离出了多个双黄酮。
C 萜类
萜类是具有(C5H8)n通式的天然化合物，以及含氧及饱和程度不等的衍人物。Wallach曾提出异戊二烯法则，根据分子中可分异戊二烯的多少分别称为单萜、倍半萜、二萜、三萜等，植物中存在的橡胶、某些色素、挥发油、树脂、苦味素等类型成分，大多属于萜类或含有萜类成分。
从青蒿中纯化出了Artemisinin，实验以异辛烷一乙酸乙酯(7：3)为固定相，甲醇一水(6：4)作为流动相；以异辛烷一甲醇一水(10：7：3)为固定相和流动相从青蒿中分离了epideox-yarteannuin;利用四氯化碳一甲醇一水(5：4：1)的溶剂系统以800r／min的转速，将Cochlospermum tinctorium(卷胚属)的根的甲醇萃取物500mg溶解在10ml的1：1的两相溶剂系统中一次进样得到纯的cochloxan-thin和dihydrocochloxanthin；以氯仿一甲醇一水(9：12：8)从龙胆的根的甲醇萃取物中分离得到了1个裂环烯醚萜甙，从Halenia campanu-lata中分离得到了2个裂环烯醚萜甙类，以氯仿一甲醇一水(7：13：8)从Abrus fruticulosus的叶中分离出了4个甜味三萜甙；从非洲植物Sesamum alat um中分离出了18，l 9-secoursane clisaccharide，两相系统为氯仿一甲醇一戊醇-2—水(5：6：1：4)；用氯仿一甲醇—异丁醇一水（7：6：3：1）的系统从积雪草的抽提物中分离了2个结构非常相似的皂角甙，1个是积雪草甙、1个是madecassoside，它们仅在同一支链上前者是H，后者是OH 。
D 木脂素
Marrston等以1g的进样较大范围地分离制备了肉挂酸、阿魏酸和咖啡酸，采用的溶剂系统为正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水(3：7：5：5)，转速700r／min。
以正己烷一甲醇一水(6：5：5)的两相系统以1500r／min的转速在80 min内曾从江花五味子果实的核的乙醇萃取物中分离了2个结构十分相似的木脂素的成分一schisanhend和它的乙酸化物，以氯仿一甲醇一水的溶剂系统从西伯利亚人参的根中分离得到了纯的eleutheroside。
Nitao等于1991年用正己烷一乙腈一乙酸乙酯一水(8：7：5：1)的两相系统从Magno1ia virginian中进行neelignans的最初纯化，它比传统的柱色谱更快、更、更经济。
E 香豆素类
用氯仿-甲醇一水（13：23：16）的两相系统一次进样140mg来自于Lomatium dissectum的样品得到了3个香豆素的甙和1个黄酮甙；用氯仿一甲醇一水(13：7：8)的两相体系分离并分析了香豆素混合物中甲醚散形酮、7-甲氧(基)香豆素、7—羟基—6—甲氧基香豆素和7—羟基香豆素；俞维乐等从Artemisia dalailamae kraschen中以氯仿一甲醇一水(2：1：1)分离出了纯的7—羟基—6—甲氧基香豆素以及isofraxdin和taxaxery1-acetate，达到了很好的分离效果。
F 其它
以氯仿一甲醇一乙酸—水(5：3：1：3)的两相系统，以800r／min的转速从90mg的商品毛地黄皂甙中分离出了几个强心甙的化台物；用HSCCC分离鞣酸；用正己烷一乙腈一叔丁基甲基醚(10：10：1)从香芹菜中分离falcarind和falcarindiel；还从香芹菜中分离得到了2个C20化合物。
HSCCC使用的溶剂体系的组成是千变万化的，各溶剂的性质也各不相同，因而具有很强的适应性，为从复杂的天然产物中提取成分提供了有利条件。因此，国际上HSCCC被大量用于天然产物各类化学成分的分离纯化，如生物碱、黄酮类、萜类、木脂素、香豆素类等，以下为一些成功应用实例：
3.2 抗生素
液-液分配的技术特别适合于抗生素的分离，HSCCC的应用也是最早从抗生素的分离开始的。采用疏水性体系，HSCCC能很好的分离抗生素混合物，例如：用苯／氯仿／甲醇／水(15∶15∶23∶7)分离依罗霉素(efortomycin)混合物[9]；用乙醚/正己烷/甲醇/水（5∶1∶4∶5）分离放线菌素（actinomycin）混合物[9]；用氯仿/甲醇/水（4∶4∶3）体系分离杀念菌素（candicidin）衍生物[9]；四氯化碳/甲醇/0.01mol/L磷酸钾缓冲液（ pH=7）(2:3:2)分离伊维菌素（ivermectin）[9]；用氯仿/乙酸乙酯/甲醇/水（3∶1∶3∶2）分离普那霉素（pristinamycins）[9]等等。
3.3 蛋白质和肽
最早人们用HSCCC分离一些小分子的肽，如：用氯仿／苯／甲醇／水(15∶15∶23∶7)分离短杆菌肽等等，随着双水相体系引入到HSCCC中，HSCCC开始应用到分离大分子蛋白。双水相分离的液-液分配原理，与高速逆流色谱有共性。但人们发现在行星平行轴式HSCCC上，双水相体系很难保留，也难以让双水相保持分层。随着正交轴式的HSCCC的发明，较好解决了平行轴式HSCCC的难题，但正交轴式的仪器，结构复杂，很难技术实现。最近深圳市同田生化技术有限公司在平行轴式HSCCC上做了一些关键技术的改进解决了双水相在平行轴仪器上保留难及不易分层的难题，此时双水相体系保留可达70%以上。这样就使大分子蛋白分离成为了可能。
3.4 食品
HSCCC应用于食品分离的最大优势是粗品或复杂样品可直接进样，一般用于食品除毒去杂或制备生物活性物质。例如用HSCCC检测食品中的毒素含量，分离SEA(导致食品污染的常见毒素)[28]；用正已烷／乙腈／叔丁基甲基醚(10∶10∶1)从香芹菜中分离falcarind和falcarindiel [29]；糖和PNP衍生物用HSCCC正交螺旋管行星式离心分离，溶剂体系是正丁醇／乙酸／水(4∶1∶5)或正丁醇／甲醇／水(4∶1∶4).分离体系通过衍生可以增加分子的疏水性，从而用HSCCC实现分离[30]。
3.5 无机物
HSCCC在分离无机物方面的应用主要集中于稀土元素或重金属元素。例如用混溶的0.5mol/LDEPHA (二乙基已基磷酸盐)和十二烷作固定相，盐酸作流动相，富集稀有元素[31]；用盐酸和氯仿(溶有0.15mol/L DEPHA)(1:1)溶剂体系分离镧系元素Sm、Gd、Tb、Dy、Er、Yb，效果良好[32]；用EHPA(乙基已基磷酸盐)和单-2-乙基已基醚的甲苯溶液体系作固定相[33]，含有镧系元家如钬和铒的溶液(相当于流动相)从上洗脱，在固定相中金属元素富集，并发现了稀有元素的复合物的保留值与流动相的pH有较大关系， pH升高，保留体积提高，但是理论塔板数下降，另外，在流动相中加入铵盐并不影响固定相保留值。根据上述方法，HSCCC可用于环境分析检测或控制污染。虽然灵敏度较低，但是固定相能够富集干扰的金属离子[34]。
3.6 其他
随着技术的发展，HSCCC应用范围逐步拓展。已经有人尝试用HSCCC拆分消旋化合物[35]。例如N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺，成功地用于氨基酸的衍生物的分离[36]。有人用HSCCC分离紫胶染料，溶剂体系是叔丁基甲基醚／正丁醇／乙醇/水(2∶2∶1∶5)，得到的物质纯度在95％左右[37]。Ma和Ito发现增加有机固定相中手性选择性试剂的含量及增大溶剂系统的疏水性可提高色谱峰的分辨率。
4 高速逆流色谱的一些新进展
4.1 与其他检测器的联用
目前HSCCC多采用紫外检测器进行在线检测，但HSCCC选用的有机溶剂及所分离的组分，有很多不适合用紫外检测，因而大家把目光投向了各种检测器与HSCCC联用技术上来。分流器技术的使用，解决了HSCCC与各种检测器联用的接口问题，目前已有HSCCC与质谱（MS）、红外（FTIR）、蒸发光散射（ELSD）联用的应用，从而为HSCCC的应用提供了一种新型多维分离分析方法。Rinehart等报道了HSCCC与电喷雾质谱（ESIMS）联用技术[4]，并评价了色谱分离和质谱分析的表现，认为制备型逆流色谱更适合于天然产物的分离分析。
近两年，国外有人成功的将HSCCC与ELSD联用，分离了7-甲氧基香豆素、橙皮素、莨菪亭、微形酮，效果非常好。深圳市同田生化技术有限公司应用HSCCC与ELSD联用，分流收集，成功的制备分离了银杏中四个内酯单体，并将之产业化。
总之，各种检测器的优点与HSCCC技术的良好地结合，为逆流色谱技术的应用开创了一个广阔的局面。
4.2双向逆流色谱
双向逆流色谱[7]（dual-mode countercurrent chromatography,简称DuCCC），即两相分别从螺旋管两端同时流入，又从相对应的端口同时流出，两相形成真正的逆向对流。与常规的HSCCC相比，DuCCC分离速度更快，分离效率更高，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的繁琐。该项技术可应用在蛋白分离。
4.3 利用HSCCC建立中药指纹图谱
中药质量可控是中药现代化的一个重要内容，中药以及复方因其复杂的成分和未明的作用机理，阻碍着中药现代化的进程。中药指纹图谱技术已成为研究中药成分及作用机理，控制中药质量，推动中药业走向世界的关键技术。HSCCC具有很好的分辨率和重现性，加上不存在固体载体吸咐，对样品的前处理要求不高或不用前处理，不存在分离过程丢失成分和成分变性的问题，因而可用于中药成分的定性或半定量分析，并整理出中药材的特征峰和指纹谱，制定标准图谱，用于中药的质量控制和测定。在高速逆流色谱指纹图谱研究方面，目前已对大黄、沙棘、何首乌等一些中药进行了研究[10]。
5 总结与展望
逆流色谱无需固体载体，能实现连续分离，有多种多样的溶剂系统可采用；不但适用于非极性化合物，而且适用于极性化合物的分离；能实现从上百毫克量到数克的制备提纯；它可用于天然产物粗提物的去除杂质，也可用于产物的精制，甚至直接从粗提物进一步纯化到达纯品；也能与质谱仪或红外光谱仪、蒸发光散射仪等联用，应用前景十分广阔。随着HSCCC技术的迅猛发展，逆流色谱将在分离制备方面发挥越来越重要的作用。
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