引言

沙棘(H ipp op hae rham noid es L. ) 是胡颓子科沙棘属的灌木亚乔木, 沙棘叶中富含黄酮类化合物。总黄酮的提取主要有水浸提法、碱水浸提法以及溶剂回流提取法[ 1～ 3 ] , 这些方法操作繁琐、提取率低。超声波可以使提取介质中的微小气泡缩、爆裂, 破碎原料的细胞壁, 加速有效成分的溶出、扩散, 可大大缩短提取时间, 提高提取效率。超声技术作为一种有效的提取方法, 已经应用于天然产物的提取研究中[ 4～ 6 ]。而超声循环技术是在料液循环流动的过程中施加超声波, 是一种提取天然产物的新技术。

1　材料与方法

1．1　原料与试剂

沙棘叶采自山西省阳高县; 芦丁标准品(中国药品生物制品检定所) ; 乙醇(95% )、石油醚(沸程60～ 90℃)、乙酸乙酯、丙酮、结晶氯化铝、氢氧化钠(北京化工厂) 均为分析纯。

1．2　主要仪器与设备

HF-2.5B 型超声循环提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司) , 用于超声循环提取; SK250H 型超声清洗仪(上海科导超声仪器有限公司) , 用于普通超声提取; 101-2 型电热鼓风干燥箱(上海沪南科学仪器联营厂) , 用于干燥原料; LD-02 型二两装高速中药粉碎机(温岭市大海药材器械厂) , 用于粉碎样品; 分样筛(上虞市沙筛厂) , 用于筛分一定目次的沙棘叶粉末; Sarto riou s 电子分析天平(德国) , 用于精密称量; 索氏提取器(北京玻璃仪器厂) , 用于回流提取; 752 型紫外光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司) , 用于测定提取液的吸光度值; TU 1901 型紫外双光束分光光度计(北京普析通用有限责任公司) , 用于全波段扫描的分析。PHS-25 型pH 计(上海精科雷磁公司) , 用于调节提取液的pH 值。

1．3　试验方法

1．3．1　原料预处理

将沙棘叶经过挑选、整理、去刺, 在110℃下烘烤至干, 留下一部分测定其含水率, 其余经粉碎后过40 目筛; 用石油醚回流除去油脂、色素等杂质, 由于石油醚是油溶性物质的良好溶剂, 所以用石油醚可以提取油脂、色素等低极性物质, 起到除杂的作用, 以免影响黄酮的提取与测定。挥干石油醚后即为沙棘叶粉末。

1．3．2　标准曲线的制作

精确称量芦丁标准品5.0 m g, 用95% 的乙醇定容至50 mL 容量瓶中, 分别取0 mL、0.5 mL、
1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 于5 mL 容量瓶中, 各加入1% 的A lCl3 溶液(溶剂为95% 乙醇) 0.5 mL , 用95% 的乙醇定容至刻度, 放置10 m in, 于430 nm 下测定其吸光度。得出线性回归方程为: A = 25.971C+ 0.0044, 式中A 为吸光度, C 为测定液质量浓度(g/L) , 相关系数r= 0.999 9。

1．3．3　提取方法

(1) 索氏提取法
准确称取沙棘叶粉末5.000 g, 用滤纸包好, 置于索氏提取器中, 加入提取溶剂80 mL 回流提取黄酮, 至提取液接近无色。将提取液浓缩至干, 即得总黄酮粗品。

(2) 超声提取方法
准确称取沙棘叶粉末5.000 g, 于250 mL 具塞三角瓶中, 加入提取溶剂, 放入超声波清洗仪中, 超声提取30 m in, 将提取液经过滤后浓缩至干, 即得总黄酮粗品。

(3) 超声循环提取法
将处理过的样品用超声波循环装置进行提取, 参数设定为: 功率1 kW , 转速1 200 r.min, 超声波工作3.5 s、间隔0.3 s。提取液经过滤后浓缩至干, 即得总黄酮粗品。

1.3.4　总黄酮测定及计算
将总黄酮粗品溶解于95% 乙醇中, 加入1% A lCl3 乙醇溶液, 定容至一定体积, 以芦丁为标准品, 利用分光光度法测定总黄酮提取率。

2　结果与讨论

2.1　佳检测波长的确定
取适量芦丁标准品溶解于95% 乙醇中, A lCl3 显色, 用TU 1901 型紫外双光束分光光度计在K为190～ 500 nm 范围内进行双光束紫外光谱扫描, 确定其佳吸收波长, 如图1。由图1 可见, 芦丁的95% 乙醇溶液在A lCl3 显色的作用下, 在430 nm 处有吸收峰, 确定为佳测定波长。

　2.2　提取溶剂的选择
文献[7 ]报道, 黄酮苷类和极性较大的苷元, 一般可用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、丙酮等提取。水虽然是廉价、易得、清洁的溶剂, 但是考虑到用水提取, 提取液中杂质较多, 还常含有粘液, 浓缩时会产生泡沫, 给进一步分离带来很多困难, 增加了成本, 且提取物容易发霉、发酵, 因此决定不采用水作为提取剂。甲醇虽然有毒, 但文献[8～ 9 ]报道, 甲醇及其溶液提取效果好, 因此本试验分别选择95% 乙醇、无水甲醇、乙酸乙酯、丙酮为提取剂, 进行索氏提取, 至提取液接近无色, 结果见表1。

              表1　不同提取剂的提取率
   提取溶剂   95%乙醇  无水甲醇  乙酸乙酯   丙酮
   提取率/%   1.958     2.112      0.571     0.696

由表1 可以看出, 无水甲醇提取率, 乙醇与无水甲醇提取效果相当, 乙酸乙酯与丙酮提取率。这是由于黄酮类化合物极性较大, 甲醇和乙醇以及相应的水溶液极性较大, 所以提取率较高; 而乙酸乙酯和丙酮相比极性较小, 相对而言提取率较低。甲醇毒性较大, 相对而言乙醇毒性小、本身有杀菌作用, 不易发霉变质, 所以后选择乙醇为沙棘叶黄酮的提取剂。

2.3　索氏提取的提取率确定

优化沙棘叶中总黄酮的提取条件, 设计三因素三水平正交试验, 影响因素为乙醇的体积分数、提取剂的pH 值、提取时间, 其因素水平表见表2, 结果见表3。

          表2　正交试验因素水平表
水平             因素
       乙醇的体积分数A /%  pH 值B           时间C/h
1                65          8.0               4
2                75          9.0               5
3                85          10.0              6

       表3　正交试验结果表
试验号     A          B         C      提取率/%
1          1          1     1       1.358
2          1          2     2       1.485
3          1          3     3       1.862
4          2          1     2       1.604
5          2          2     3       1.978
6          2          3     1       1.600
7          3          1     3       1.146
8          3          2     1       1.034
9          3          3     2       1.130
Ⅰ        4.705     4.108   3.992
Ⅱ        5.182     4.497   4.219
Ⅲ         3.310    4.592   4.986
R         0.624 0   0.161 3  0.331 3

由表3 可知, 各个因素的影响顺序是A 、C、B , 较佳组合为A 2B 2C3, 即以75% 的乙醇为提取剂、pH 值为9.0、时间为6 h, 可以得到较好的效果, 提取率达到1.978%。

2.4　超声提取试验

2.4.1　料液比和pH 值的确定

用普通超声提取法对料液比和pH 值进行初探, 对料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 进行试验, 其提取率分别为1.091%、1.372%、1.432%、1.472% , 可见料液比对黄酮的提取率有一定的影响, 随着料液比的降低提取率升高, 在1∶25 之后变化很小。而且考虑到料液比太高循环会有一定的困难, 从而影响提取率, 料液比太低会增加溶剂的用量, 后选择料液比为1∶25。对溶剂pH 值6.0、7.0、8.0、9.0 进行试验, 提取率分别为1.432%、1.444%、1.454%、1.468% , 可见提取溶剂的pH 值对超声提取的提取率影响不大, 这是由于超声破碎作用的影响掩盖了pH 值的影响。所以选择溶剂在固定的pH 值下进行提取, 经测定75% 乙醇的pH 值为7.4, 这是与索氏提取的一个不同之处。

2.4.2　乙醇体积分数和超声时间对提取率的影响

　超声循环提取法提取沙棘叶中总黄酮, 乙醇的体积分数对提取率影响很大, 75% 的乙醇提取率, 其次是50% 的乙醇, 乙醇的体积分数较高或者较低, 提取率均不佳。对于同一体积分数的乙醇, 随着提取时间的增加, 提取率升高, 但是达到一定程度后提取率反而随着时间的增加而降低。这是由于随着超声时间的增加, 某些黄酮类化合物受到了破坏的缘故。后选择超声循环提取的溶剂体积分数为75% , 提取时间为20 m in。

2.5　超声循环提取法与普通超声提取法、索氏提取法的对比

将超声循环提取法与普通超声提取法、索氏提取法相比较, 结果见表4。


        提取方法                提取参数                        提取率/%
            乙醇体积分数/%  pH 值  提取时间/min   
超声循环提取法        75          7.4      10/20/30     1.919/2.144/2.194
普通超声提取法        75          7.4      30           1.432
索氏提取法            75          9.0      360          1.978

由表4 可见, 利用超声循环提取法, 提高了沙棘叶中总黄酮的提取效率, 用75% 的乙醇进行沙棘叶中总黄酮的提取, 超声提取10m in 即与索氏提取6 h 的提取效果相当, 同时远高于普通超声提取。超声循环提取采用物料循环、超声场固定分布、物料在超声场中顺序移动的技术, 达到快速提取的目的, 提取效率较普通超声提取有很大的提高。



3　结束语

75% 乙醇用于不同提取方法中提取沙棘叶中总黄酮, 均为溶剂的佳体积分数。超声循环提取的效果明显优于普通超声提取与索氏提取。超声提取与索氏提取相比, 节约了时间和能耗, 且提取工作在室温下进行, 可避免高温对提取成分的影响。超声循环提取在沙棘叶总黄酮的提取中具有明显的优势, 是一种具有发展前景的天然产物提取技术。

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