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可溶性PTA分子的发现及其检测方法

阅读次数：161发布时间：2009/6/22 13:51:00

目的建立检测sPTA1的方法，探讨正常人和肿瘤患者血清中是否存在可溶性PTA1分子。方法以亲和层析法从血小板纯化的天然PTA1分子作为免疫原，制备抗PTA1分子的多克隆抗体，并以此建立检测sPTA1的双抗体夹心ELISA法。结果建立的双抗体夹心ELISA法敏感性达100ng/L，应用此方法从经TPA，PHA及抗CD3mAb活化的人PBMC细胞培养上清中检测到sPTA1。与膜型PTA1分子表达的动态相关研究发现，sPTA1的产生晚于mPTA1分子的表达，且可持续存在。检测60例正常人血清sPTA1的水平为μg/L，16例肿瘤患者为μg/L。血清中sPTA1相对分子质量约为50000。结论首次发现sPTA1分子，建立了具有较高敏感性和特异性的检测sPTA1的方法，为进一步深入研究PTA1分子的生物学功能提供了新的手段。

关键词：夹心ELISA；PTA1；可溶性粘附分子

许多免疫细胞膜分子存在膜型和可溶性两种形式。某些可溶性形式的分子对于其膜型分子功能的发挥和调节，以及对一些疾

病的发生、诊断及预后判定具有重要的意义。血小板/T细胞活化抗原1是免疫细胞膜上一种新的分子［1］。1997年基因克隆成功［2］，主要分布于活化T细胞、NK细胞、巨核/血小板谱系及内皮细胞。PTA1分子参与杀伤性T细胞的分化、血小板的活化与凝集［2，3］，是一种刺激型NK细胞受体［2］。临床初步研究表明，PTA1分子与血小板功能异常、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、肿瘤及移植物抗宿主病等的发病关系密切［4，5］。我们首次证实，细胞培养上清和人血清中存在可溶性PTA1分子，并讨论了其生理意义及与临床疾病的关系。

1材料和方法

1.1材料新西兰纯种兔由本校动物中心提供。PMSF，碘乙酰胺，胰蛋白酶抑制剂，PHA，TPA，ABTS和FITC标记的抗鼠抗体，均为Sigma公司产品。Sepharose4B购自Pharmaia公司，WesternBot试剂盒为BoheringerMannheim公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体购自博士德公司。抗CD3mAb、抗PTA1mAbLeoA1和FITC标记的抗兔抗体为本室制备。ELISA板为Nun公司产品。

1.2方法

1.2.1PTA1的纯化及其Mr的测定离心收集人血小板置裂解缓冲液中，其组成为1

0mmo/LTrisHC，1％NP40，150mmo/LNaC，2mmo/LPMSF，20mmo/L碘乙酰胺，10mg/L胰蛋白酶抑制剂及1g/LBSA。于4℃缓慢搅拌1h后，以27000g离心15min，除去不溶性物质［3］。亲和层析方法依照Pharmaia公司Sepharose4B操作说明书进行。以不同稀释度经LeoA1Sepharose4B亲和层析柱纯化的PTA1分子包被ELISA板，用间接ELISA法检测其免疫反应性。纯化PTA1分子的相对分子质量的鉴定：纯化的PTA1分子进行SDSPAGE，转移PVDF膜，封闭后，与抗PTA1分子的多抗及对照多抗1F12进行反应，余按照BoheringerMannheim公司Westernbot试剂盒说明书进行操作。

1.2.2sPTA1检测方法的建立选取雄性新西兰纯种兔，按照常规方法制备兔抗PTA1的PAb，建立检测sPTA1的夹心ELISA法。主要步骤为：以不同浓度的mAbLeoA1包被ELISA板，依次加入不同浓度的PTA1/Ig融合蛋白，然后分别加兔抗PTA1抗体及HRP标记的羊抗兔抗体，每步骤间均经温育和洗涤，用ABTS底物显色后，测波长410nm处光吸收值。同时设立空白、正常兔血清对照及包被无关mAb1F12的对照。对建立的方法，按常规进行批内、批间稳定性实验。

1.2.3PTA1的检测分离人PBMC，调整细胞浓度至5×109/L，以终浓度为20mg/L的抗CD3mAb，5mg/L的PHA或50μg/L的TPA分别活化人PBMC。于不同时间点收集细胞培养上清检测sPTA1，同时收集细胞，按

照常规进行间接免疫荧光染色。抗CD3mAb刺激细胞采用兔抗PTA1PAb，PHA和TPA刺激细胞采用mAbLeoA1，分别与活化的PBMC反应，洗涤后加FITC标记的抗兔或抗鼠抗体与细胞反应，后用流式细胞仪检测mPTA1分子的表达。收集正常人血清、肿瘤患者血清以及细胞培养上清，用上述建立的夹心ELISA方法检测sPTA1。

1.2.4sPTA1Mr的测定取正常人血清，用mAbLeoA1或对照抗体1F12做免疫沉淀后，再以抗PTA1PAb进行Westernbot测定sPTA1的Mr。

2结果

2.1纯化PTA1分子及其多克隆抗体的鉴定纯化的天然PTA1分子保持了较好的免疫反应性，与无关抗体未出现交叉反应。Westernbot结果表明，纯化PTA1仅出现1条带，其Mr约为67000。ELISA检测结果表明，免疫兔产生的抗PTA1分子PAb与其它蛋白无交叉反应，抗体效价为2.5×10-7。

elisa, 试剂盒

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